结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤和第二大癌症相关死亡原因，其发生发展与遗传易感性和环境因素之间的复杂相互作用密切相关。炎症性肠病作为重要的环境风险因素显著增加了结直肠癌的发病风险，然而结直肠癌早期症状不典型，在炎症-腺瘤-癌变过程中缺乏明确的疾病进展标志物。目前，结肠镜检查作为金标准诊断工具具有侵入性且成本高昂，对早期肿瘤的敏感性有限，而非侵入性替代方法如粪便潜血测试则因特异性低且无法检测癌前病变而受限。因此，识别敏感且特异的早期标志物对于结直肠癌及癌前病变的早期检测至关重要。

肠道菌群作为重要的环境风险因素之一，通过影响结直肠癌的起始、发展和转移过程参与疾病发生，结直肠癌患者肠道菌群失调的特征是粪便中毒力细菌如大肠杆菌、志贺氏菌、拟杆菌和梭菌的水平升高，尽管如具核梭杆菌和产毒脆弱拟杆菌等特定菌种与结直肠癌致癌机制已有明确联系，但志贺氏菌尤其是福氏志贺氏菌在结直肠癌患者组织中显著富集，其除急性炎症反应外的具体作用机制尚不明确，缺乏关于福氏志贺氏菌是否参与结直肠癌起始和进展及其分子机制的系统研究。

为此，本研究采用非靶向代谢组学技术分析结直肠癌患者粪便样本以鉴定差异代谢物，从而分离并鉴定出一种新型促癌福氏志贺氏菌菌株（命名为福氏志贺氏菌C.11），并进一步阐明该菌株诱导DNA损伤及促进炎症向肿瘤转变的分子机制，同时评估福氏志贺氏菌C.11及其相关代谢物作为非侵入性早期诊断生物标志物的临床潜力，为结直肠癌早期筛查和治疗靶点开发提供新视角。研究纳入49例结直肠癌患者、45例溃疡性结肠炎患者和46例健康对照者的血清样本，以及20例结直肠癌患者、22例溃疡性结肠炎患者和20例健康对照者的粪便样本，同时收集10例结直肠癌患者的癌组织及癌旁正常组织，所有样本在分析前保存于零下80摄氏度，采用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱系统进行代谢物分离，通过Zorbax extend C18色谱柱以0.1%甲酸水溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，质谱参数设定为碎裂电压120伏特、雾化器气压35磅每平方英寸、毛细管电压4千伏、干燥气流速9升每分钟、温度325摄氏度，数据采集范围设置为质荷比50至1500。

粪便样本处理时与预冷去离子水混合后离心取上清，加入内标溶液并用甲醇沉淀蛋白，涡旋离心后取上清进行质谱分析，血清样本处理时全血凝固后离心取血清，加入内标工作液并用甲醇沉淀蛋白，过滤后进样分析，通过选择性培养基从结直肠癌患者粪便中分离胍丁胺产生菌，采用单菌落法纯化培养，最终菌株用30%甘油保存于零下20摄氏度。动物实验部分采用偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结直肠癌模型，30只C57BL/6J小鼠随机分为空白组和模型组，模型组腹腔注射偶氮甲烷并给予2%葡聚糖硫酸钠循环处理，伪无菌小鼠模型通过抗生素混合物处理14天清除大部分肠道菌群后，分别移植大肠杆菌K12和福氏志贺氏菌C.11，结肠炎小鼠模型分为对照组、偶氮甲烷-葡聚糖硫酸钠组、葡聚糖硫酸钠组及环二肽处理组，分别给予生理盐水或不同环二肽灌胃处理，所有动物操作均经中国药科大学动物伦理委员会批准。

结果发现，通过非靶向代谢组学分析140名参与者的血清样本和62名参与者的粪便样本，偏最小二乘判别分析显示结直肠癌患者血清和粪便样本可与健康对照及溃疡性结肠炎患者区分，鉴定出70种差异代谢物。’京都基因与基因组百科全书通路（KEGG）分析显示，结直肠癌患者中甲硫氨酸、生物素、甜菜碱代谢、甘氨酸和丝氨酸代谢以及缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸降解通路发生改变。

热图分析显示，结直肠癌患者血清和粪便中胍丁胺水平显著高于健康对照和溃疡性结肠炎患者，受试者工作特征曲线分析表明胍丁胺在两种样本中的曲线下面积均超过0.7，提示其诊断价值。体外肠道模拟器实验证实肠道菌群可代谢产生胍丁胺，抗生素处理小鼠体内胍丁胺水平显著降低，偶氮甲烷-葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎相关癌症模型中胍丁胺含量随疾病进展逐渐增加，但胍丁胺仅在1微克每毫升浓度时诱导DNA损伤标志物γH2AX表达上调，而临床粪便中胍丁胺生理浓度远低于此阈值，表明正常条件下无直接基因毒性。

图1 CRC中血清和粪便样本的代谢改变

通过选择性培养鉴定出福氏志贺氏菌为主要胍丁胺产生菌，分离纯化出新型菌株福氏志贺氏菌C.11，经质谱和全基因组测序表征，比较基因组分析显示该菌株缺乏大肠杆菌pks+毒力岛基因，透射电镜显示其具有细胞侵袭性，彗星实验和免疫荧光分析证实该菌株诱导DNA双链断裂，γH2AX表达在共培养4小时后升高，低分子量组分（小于3千道尔顿）培养液处理可升高γH2AX表达水平，且DNA损伤严重程度随时间增加。线虫模型实验中，喂食福氏志贺氏菌C.11的线虫寿命显著缩短，伴随肠道屏障功能严重破坏，肿瘤抑制蛋白p53同源物CEP-1转录上调，肠道细胞核不对称分裂增加，表明该菌株具有细胞侵袭性并能产生激活DNA损伤反应的代谢物，提示其潜在致癌风险。

伪无菌小鼠模型中，福氏志贺氏菌C.11定植后结肠长度显著缩短，血清促炎细胞因子白介素1β和白介素6水平上调，癌胚抗原和甲胎蛋白水平升高，组织学检查显示肠腔出现增生性突起、黏膜上皮细胞表面粗糙不平、上皮细胞密集排列不规则、坏死细胞及纤维蛋白渗出，增殖标志物Ki67和增殖细胞核抗原表达显著上调且持续升高，表明福氏志贺氏菌C.11促进肠道炎症发展并具有促癌进展趋势。配体垂钓结合高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱筛选出三种环二肽（环脯氨酸-亮氨酸、环苯丙氨酸-脯氨酸、环脯氨酸-缬氨酸）作为潜在基因毒性代谢物，连续传代培养显示环二肽处理导致细胞形态由圆形变为纺锤形、排列混乱重叠，细胞内γH2AX激活和DNA双链断裂增加，细胞周期S期细胞增多而G2/M期细胞减少，细胞增殖和迁移能力增强，软琼脂集落形成实验表明环二肽1和环二肽2处理的细胞获得非锚定依赖性生长特性。

结肠炎小鼠模型中，环二肽处理组体重下降显著且存活率降低，结肠长度缩短，肿瘤数量增加，组织学检查显示白细胞浸润、黏膜溃疡、隐窝破坏及高级别上皮内瘤变，Ki67阳性区域百分比显著升高，血清白介素1β、白介素6、癌胚抗原和甲胎蛋白水平升高，表明环二肽促进结肠炎小鼠体内肿瘤发展。转录组测序显示福氏志贺氏菌C.11处理组中674个基因上调和666个基因下调，基因本体和京都基因与基因组百科全书富集分析揭示tRNA氨酰化、碱基代谢、ATP酶激活和氨酰基连接酶激活通路差异显著，免疫荧光和Western blotting证实福氏志贺氏菌C.11上调ERBB3和神经调节蛋白1表达，激活PI3K-AKT-mTOR通路磷酸化，环二肽同样直接激活ERBB3及下游关键蛋白表达。

图2 福氏志贺氏菌C.11在体外引起DNA损伤，但不是通过胍丁胺

临床验证中，癌症基因组图谱和基因型-组织表达数据库整合分析显示ERBB3在结肠腺癌和直肠腺癌组织中显著上调，其高表达与结直肠癌患者总生存期缩短显著相关，荧光原位杂交显示福氏志贺氏菌C.11在结直肠癌肿瘤组织中定植密度显著高于癌旁正常组织，免疫荧光分析证实ERBB3和γH2AX在肿瘤组织中表达上调，Spearman相关分析显示菌株定植密度与ERBB3表达及γH2AX水平呈强正相关，肿瘤组织中ERBB3与γH2AX显著相关而癌旁正常组织中无统计学意义，热图进一步支持三者在结直肠癌中的协同作用。粪便样本回归分析显示结直肠癌患者中福氏志贺氏菌C.11丰度及环二肽1和环二肽2水平显著升高，受试者工作特征曲线分析表明除环二肽3外所有生物标志物曲线下面积均大于0.7，环二肽2曲线下面积最高达0.856，多指标联合诊断将曲线下面积提高至0.887，表明福氏志贺氏菌C.11及其代谢物具有显著诊断价值。

本研究首次报道从福氏志贺氏菌中分离出小分子代谢物环二肽，其持续暴露触发DNA双链断裂导致细胞形态、增殖、迁移、锚定非依赖性生长和细胞周期进程的显著改变，最终驱动恶性转化，体内实验证实环二肽加速结肠炎模型小鼠肠道肿瘤发生，全基因组分析发现福氏志贺氏菌C.11存在非核糖体肽合成酶基因簇，提示环二肽合成可能依赖非核糖体肽合成酶途径。

福氏志贺氏菌C.11及其代谢物通过激活ERBB3/神经调节蛋白1/PI3K-AKT-mTOR信号通路促进正常肠上皮细胞恶性转化和肠道肿瘤进展，抑制该通路可能成为结直肠癌治疗新策略，尤其针对福氏志贺氏菌富集病例，靶向神经调节蛋白1、ERBB3及其下游信号通路具有治疗潜力。福氏志贺氏菌C.11和环二肽在结直肠癌患者粪便样本中显著富集，联合分析其丰度与水平可显著提高诊断准确性，作为非侵入性早期诊断工具具有重要临床价值，但肠道菌群组成的地理变异、饮食习惯、抗生素暴露或环境因素可能限制其作为通用生物标志物的普适性，未来需开展多中心研究验证其 prevalence 和诊断效能，并改进标准化检测方法，结合现有筛查策略提高结直肠癌早期检测水平。

原始出处：

Rui Zhang, Mingxiao Li, Hui Tan, Jianyao Liu, Lu Wang, Wenling Dai, Zhimin Fan & Jihua Liu (2025) A new gut pathogenic bacteria and its metabolites promote colorectal cancer development and act as non-invasive early diagnostic biomarkers, Gut Microbes, 17:1, 2555446, DOI: 10.1080/19490976.2025.2555446

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