糖尿病骨质疏松（DOP）是糖尿病最常见的慢性骨并发症之一，以骨量减少、微结构破坏和骨折风险显著升高为特征。临床统计显示，糖尿病患者发生骨质疏松及骨折的概率比正常人群高4～5倍，而30%～50%的糖尿病患者存在骨强度下降。长期高血糖通过氧化应激、晚期糖基化终产物（AGEs）积聚及慢性炎症反应，抑制成骨细胞（OB）分化，同时激活破骨细胞（OC），最终导致骨形成减少、骨吸收增加。目前西医治疗以降糖药联合抗骨质疏松药为主，但存在胃肠道反应明显、价格昂贵、长期依从性差等问题。

传统中医认为“肾主骨生髓，肝主筋藏血”，DOP病机属“消渴并发骨痿”，治宜“滋阴补肾、填精益髓”。熟地黄（RR）与山茱萸（CF）是滋阴补肾经典药对，临床常用于糖尿病及骨质疏松防治，但其确切作用机制尚未阐明。

浙江中医药大学团队以链脲佐菌素诱导的1型糖尿病骨质疏松大鼠及高糖损伤MC3T3-E1成骨细胞为模型，结合UPLC-Q-Exactive-MS、Micro-CT、网络药理学及分子生物学技术，系统揭示了“RR-CF”通过PI3K/AKT通路改善DOP的分子机制，为中医药防治糖尿病骨质疏松提供了现代科学依据。

图1 论文首图

RR-CF的化学成分分析

利用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q-Exactive-MS）共鉴定出56个化合物，其中含量最高的前10个成分依次为莫诺苷、马钱苷、山栀子苷甲酯、甘露三糖、没食子酸、5-羟甲基糠醛、马钱酸、桃叶珊瑚苷、獐牙菜苷及原儿茶酸，占总面积31.86%。网络药理学进一步筛选出口服生物利用度（OB）＞30%、类药性（DL）＞0.18的17个活性成分，并结合文献报道补充6个具有明确抗糖尿病或抗骨质疏松作用的化合物，最终锁定山茱萸苷、羟基芫花素、毛蕊花苷、梓醇、松果菊苷等为潜在关键活性成分，为后续机制研究奠定基础。

图2 RR-CF的化学成分分析

RR-CF参与调节糖尿病骨质疏松大鼠的骨代谢

实验采用55 mg/kg链脲佐菌素一次性腹腔注射建立T1DM大鼠模型，造模7天后FBG＞16.7 mmol/L即为成功；随后连续10周灌胃给予RR、CF单味及RR-CF低（1 g/kg）、中（2 g/kg）、高（4 g/kg）剂量。结果显示，糖尿病模型组大鼠体重下降、FBG升高、尿钙（U-Ca）、尿脱氧吡啶啉（U-DPD）、血清Ⅰ型胶原羧端肽（CTX-1）及抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）显著高于正常对照组，提示骨吸收亢进；而骨钙素（OCN）无显著变化。与模型组比较，RR-CF中、高剂量显著降低U-Ca、U-DPD、CTX-1和TRAP水平，且中剂量RR-CF降低U-Ca的作用优于单味RR或CF，表明RR-CF可有效抑制糖尿病大鼠骨量丢失，降低骨代谢高转换状态。

图3 RR-CF参与调节糖尿病骨质疏松大鼠的骨代谢

RR-CF治疗改善DOP大鼠骨组织微结构

Micro-CT三维重建结果显示，糖尿病大鼠股骨远端松质骨呈现典型骨质疏松表现：骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）及厚度（Tb.Th）显著下降，骨表面积/骨体积比（BS/BV）及骨小梁分离度（Tb.Sp）显著升高。10周药物干预后，中剂量RR-CF可显著逆转上述指标，BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th分别提升约1.4、1.3、1.2和1.1倍，Tb.Sp降低约25%，疗效优于单味RR或CF，且与二甲双胍相当。影像学直观可见，RR-CF组骨小梁连续性明显改善，骨微结构趋于致密，提示RR-CF可修复糖尿病导致的骨微结构损伤，恢复骨生物力学性能。

图4 RR-CF治疗改善DOP大鼠骨组织微结构

网络药理学分析

基于TCMSP、GeneCards、OMIM等数据库构建“成分-靶点-疾病”网络，共获得247个化合物靶点与3630个DOP疾病靶点的交集94个潜在靶标。PPI网络拓扑分析筛选出AKT1、TNF、SRC、PTGS2、MMP9、EGFR、ESR1、HSP90α、HIF1A、PPARG等33个核心靶点；GO和KEGG富集显示，RR-CF主要通过PI3K-AKT、雌激素、IL-17、MAPK及TNF等信号通路调控激素分泌、炎症反应和能量代谢。分子对接证实山茱萸苷、羟基芫花素、毛蕊花素、梓醇、松果菊苷与AKT1、EGFR、TNF、MMP9、HSP90α结合能均<-5 kcal/mol，提示结合活性良好，进一步验证网络预测可靠性。

图5 网络药理学分析

RR-CF含药血清激活高糖损伤成骨细胞中的PI3K/AKT通路

体外采用50 mM葡萄糖预处理2天、100 mM葡萄糖维持培养建立高糖损伤MC3T3-E1模型，并给予不同剂量RR-CF含药血清。Western blot显示，高糖显著下调p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值，而中剂量RR-CF血清可明显上调上述磷酸化水平；加入PI3K特异性抑制剂LY294002后，RR-CF的激活效应被逆转，说明RR-CF通过激活PI3K/AKT通路抵抗高糖对成骨细胞的损伤。

图6 RR-CF含药血清激活高糖损伤成骨细胞中的PI3K/AKT通路

RR-CF含药血清通过PI3K/AKT通路增强高糖损伤成骨细胞的成骨能力

CCK-8、ALP染色及茜素红矿化结节实验表明，高糖显著抑制成骨细胞增殖、ALP活性及矿化结节形成。RR-CF含药血清呈剂量依赖性恢复细胞活力，提高ALP活性约1.8倍，矿化结节面积增加约2倍，同时上调COL-1、BMP2、Runx2蛋白表达；LY294002阻断后，上述成骨指标均被显著抑制，提示RR-CF通过PI3K/AKT轴促进成骨细胞分化与基质矿化，是其改善DOP的核心机制之一。

图7 RR-CF含药血清通过PI3K/AKT通路增强高糖损伤成骨细胞的成骨能力

RR-CF含药血清通过PI3K/AKT通路调控炎症反应和MAPK通路

ELISA检测细胞上清炎症因子发现，高糖本身未显著升高TNF-α、IL-17水平，但RR-CF中剂量仍能进一步降低二者含量，LY294002反而增强RR-CF的抑炎作用，提示炎症调控存在PI3K/AKT依赖与非依赖双重途径。Western blot结果显示，高糖抑制ERK、p38磷酸化及ERα表达，RR-CF可逆转此现象，而LY294002阻断PI3K/AKT后，RR-CF对ERK、p38及ERα的上调效应被削弱。由此可知，RR-CF通过PI3K/AKT通路交叉调控MAPK与雌激素信号网络，协同降低炎症水平、恢复成骨细胞功能，从而多维度、多靶点改善糖尿病骨质疏松。

图8 RR-CF含药血清通过PI3K/AKT通路调控炎症反应和MAPK通路

小结

本研究首次从“成分-靶点-通路-表型”四维角度系统阐明RR-CF药对通过激活PI3K/AKT信号轴、调控MAPK与雌激素通路、抑制炎症反应，显著改善糖尿病大鼠骨代谢失衡与微结构破坏，为临床以滋阴补肾法防治糖尿病骨质疏松提供了现代科学依据。未来可在T2DM、老龄及去卵巢复合模型中进一步验证其普适性与长期安全性，并开展活性成分体内药代动力学及多组学研究，推动经典药对的现代化与国际化。

参考文献：Hu SJ, Chen GC, Wang FY, Fang YQ, Wang SQ, Song ZL, Zhao ZH, Zhang QL, Meng XY, Zhang QY, Qin LP. Network pharmacology analysis uncovers the mechanism of Shudihuang-Shanzhuyu herb pair in prevention and treatment of diabetic osteoporosis via PI3K/AKT pathway. J Ethnopharmacol. 2025 Apr 9;345:119581. doi: 10.1016/j.jep.2025.119581. Epub 2025 Mar 5. PMID: 40054640.